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Modifizierung von DNA-Reparaturproteinen auf Expressionsebene zur Optimierung der therapeutischen Genom Editierung
Christian Thiel (Taschenbuch, Deutsch)
★★★★★
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Beschreibung
Erbliche Netzhautdefekte werden durch zahlreiche krankheitsauslösende Mutationen verursacht. Das therapeutische Genome Editing zielt darauf ab, diese Mutationen direkt im Genom des Patienten zu therapieren. Das Prinzip beruht hierbei auf programmierbaren Endonukleasen, mit denen man einen künstlichen Doppelstrangbruch erzeugen kann, welcher anschließend durch zelleigene Mechanismen repariert wird.… Durch Reparatur des DSB mittels des fehleranfälligen NHEJ-Wegs kommt es zur Ausbildung von Insertionen und Deletionen und somit zur Genveränderung. Beim HDR-Reparaturweg kann ein DNA-Template durch homologe Sequenzen in das Genom eingebracht werden. Je nach Gestaltung des Templates kommt es zur Genkorrektur, -modifikation oder -addition. Der HDR-Reparaturweg ist in den postmitotischen Photorezeptor- und RPE-Zellen jedoch ineffizient.
Ziel dieser Arbeit war es, die NHEJ-Aktivität herab zu regulieren, sodass der HDR-Reparaturweg effizienter wird. Hierzu wurde die Expression der im NHEJ-Weg involvierten Nuklease Artemis in murinen Zelllinien durch zwei verschiedene Methoden inhibiert. Artemis ist bei der Endprozessierung der freien DNA-Enden eines DSB beteiligt.
Zunächst wurde ein CRISPR/Cas9 vermittelter Knockout des murinen Artemis-Gens in den C2C12 und NIH 3T3 Zelllinien durchgeführt. Zuvor wurden die gRNA/Cas9 Konstrukte erfolgreich auf ihre Schneideeffizienz geprüft.
Der zweite Ansatz war ein siRNA-vermittelter Artemis-Knockdown in den murinen NIH 3T3 Zellen.
Die NHEJ-Aktivität nach einem Artemis Knockout/Knockdown wurde durch eine BRET-basierte Methodik gemessen. Hierbei ergab sich keine reproduzierbare Herabregulation der NHEJ-Events.
Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse weisen auf keinen oder beschränkten Einfluss eines Artemis Knockout/Knockdown auf die NHEJ-Aktivität hin. Dies kann unter anderem darin begründet sein, dass die DNA-Endprozessierung nach einem Artemis Knockout/Knockdown von anderen Nukleasen übernommen wird.
In Zukunft sollten die Funktionsweisen der in den Reparaturwegen involvierten Proteine weiterhin genau erforscht werden, um eine bestmögliche Therapiestrategie zu entwickeln. Dieses Produkt haben wir gerade leider nicht auf Lager.
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Technische Daten
Erscheinungsdatum
22.10.2020
Sprache
Deutsch
EAN
9783835968882
Herausgeber
VVB Laufersweiler Verlag
Serien- oder Bandtitel
Edition Scientifique
Sonderedition
Nein
Autor
Christian Thiel
Seitenanzahl
116
Einbandart
Taschenbuch
Einbandart Details
Paperback
Schlagwörter
Uni, Doktorarbeit, Wissenschaft
Thema-Inhalt
MK - Medizinische Spezialgebiete
Höhe
210 mm
Breite
14.6 cm
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