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Analyse und Optimierung der Matrixeigenschaften in der MALDI-Massenspektrometrie

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Analyse und Optimierung der Matrixeigenschaften in der MALDI-Massenspektrometrie

Thorsten W. Jaskolla (Gebundene Ausgabe, Deutsch)

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Beschreibung

Zielsetzung dieser Arbeit war eine Erhöhung der Detektionsempfindlichkeit der matrix-unterstützten Laserdesorption/Ionisation (MALDI), um sowohl bislang unzugängliche Analytklassen zu erschließen und dadurch die Anwendungsbreite und den Nutzen dieser Technik zu vergrößern, als auch, um bestehende Detektionsgrenzen von mit MALDI analysierbaren Stoffklassen - allen voran die der Proteine und Peptide - zu überwinden und damit der Notwendigkeit höherer Nachweisempfindlichkeiten Rechung zu tragen. Zur Erfüllung dieser Zielstellung sollte die das zentrale Element der MALDI-Massenspektrometrie repräsentierende Matrix durch Derivatisierung ihrer funktionellen Gruppen analysiert und darauf aufbauend die Matrix-Eigenschaften im Rahmen eines rationalen Designs optimiert werden. Für diesen Ansatz wurde von der Kernstruktur der für MALDI meistgenutzten Matrix a-Cyan-4-hydroxyzimtsäure (CHCA), der a-Cyanzimtsäure (CCA), ausgegangen und diese strukturell modifiziert. In diesem Zusammenhang wurde die Protonen-Affinität der Matrix vermindert, wodurch Gasphasen-Protonenübertragungen protonierter Matrizes auf neutrale Analyte mit einer höheren Exothermie einhergehen. Die Absenkung der Protonen-Affinität wurde durch elektronenziehende Halogen-Substituenten erwirkt, die durch Verminderung der Elektronendichte des chromophoren Systems eine Delokalisation der positiven Ladung protonierter Matrizes einschränken. Diese Reaktivitätserhöhungen gehen aufgrund der verringerten Elektronendichte des chromophoren Systems mit hypsochromen Verschiebungen der Absorptionsbanden einher, weshalb nur wenige der mehr als 100 synthetisierten Derivate zusätzlich zu hohen Reaktivitäten noch ausreichendes Absorptionsvermögen bei den Anregungswellenlängen der kommerziell verfügbaren Lasersysteme sowie für MALDI geeignete Morphologien aufweisen. Die erfolgreichsten Derivate sind die mono- und dihalogenierten a-Cyanzimtsäuren 4-Chlor-CCA (ClCCA) und 2,4-Difluor-CCA (DiFCCA), die sich beide durch die bisher niedrigsten Protonen-Affinitäten von MALDI-Matrizes und unerreichten Sensitivitäten auf den Gebieten der Peptid- und Lipid-Analytik auszeichnen. Die hohe Sensitivität von ClCCA wird an einer Vielzahl von Proteinen verdeutlicht, die in unterschiedlichen Mengen sowohl von spezifischen als auch wenig(er) spezifischen Proteasen lösungs- und gelverdaut wurden. Mit ClCCA konnten deutlich mehr Peptide als mit der bisherigen Standardmatrix CHCA detektiert werden, wobei ein Großteil der zusätzlich detektierbaren Peptidmenge auf kleine und wenig basische Peptide entfällt. Die stärksten Informationszugewinne konnten für Proteolysen niedrig konzentrierter Proteine erzielt werden. Weiterhin konnten durch die höhere Reaktivität von ClCCA sehr viele nur niedrig-abundante Peptide detektiert werden, deren Nachweis mit CHCA nicht möglich war, darunter solche mit seltenen posttranslationalen Modifikationen und semispezifisch geschnittene Peptide. Dies wird weiterhin in einer gegenüber CHCA stark erhöhten Detektionsempfindlichkeit von Phosphopeptiden verdeutlicht. Eine direkte Anwendung in der Praxis findet ClCCA in der gezeigten massenspektrometrischen Strukturaufklärung eines neuen stark posttranslational modifizierten Lantibiotikums, welches sich in seiner unsuccinylierten Form gegenüber zahlreichen Testkulturen als antibiotisch sehr aktiv erwies und dessen strukturelle Analyse mit alternativen Matrizes in der hier vorgestellten Form nicht zu verwertbaren Ergebnissen führte. Die vielfältigen Einsatzgebiete der in dieser Arbeit entwickelten Matrizes und ihre weit über reine Peptid-Analytik hinausgehenden Anwendungsmöglichkeiten finden weiterhin Ausdruck in der erstmaligen Charakterisierung von halogenierten Phospholipiden als wichtige Intermediate der Immunabwehr mittels MALDI-Massenspektrometrie. Auch konnte die Detektion von protonierten und kationisierten Lipiden mit diesen Matrizes drastisch verbessert werden, wie anhand verschiedener Beispiele unter Verwendung von DiFCCA verdeutlicht wird, bei denen bis zu 10fache S/N-Steigerungen gegenüber alternativen, speziell in der Lipid-Analytik Einsatz findenden Matrizes erzielt wurden. Weniger zeigen

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Produktinformationen

Technische Daten

Erscheinungsdatum

01.11.2010

Sprache

Deutsch

EAN

9783832295660

Herausgeber

Shaker

Serien- oder Bandtitel

Berichte aus der Biochemie

Sonderedition

Nein

Autor

Thorsten W. Jaskolla

Seitenanzahl

289

Auflage

Einbandart

Gebundene Ausgabe

Schlagwörter

CHCA, MALDI, Massenspektrometrie, DiFCCA, CICCA

Thema-Inhalt

PSB - Biochemie

Höhe

297 mm

Breite

21 cm

Warnhinweise und Sicherheitsinformationen

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